Определение резус-фактора плода по крови матери – методы диагностики и вычисления

Определение Rh плода по крови матери

Описание исследования

Резус (Rh) является одной из важнейших систем эритроцитарных антигенов, клинически значимой для определения степени риска развития резус-конфликта и гемолитической болезни плода новорожденного (данная болезнь обусловлена несовместимостью матери и плода по антигенам эритроцитов и очень часто является причиной желтухи и малокровия у новорожденных).

Из пяти антигенов системы резус наибольшую иммуногенность (способность вызывать ответ иммунной системы организма) проявляет антиген D, кодируемый геном RHD. Положительный резус-фактор (Rh+) характеризуется присутствием данного антигена на поверхности эритроцитов, отрицательный резус-фактор (Rh-) – его отсутствием. Соотношение лиц с положительным и отрицательным резус-фактором приблизительно составляет 86 к 14% соответственно.

Частым осложнением беременности женщины с отрицательным резус-фактором является развитие гемолитической болезни плода. Данное состояние обусловлено попаданием через плаценту в кровь матери эритроцитов вынашиваемого ребенка. Подавляющее число случаев ГБН (гемолитической болезни новорожденного) вызывается действием D-резус-антигеном. Его попадание в кровь матери становится причиной образования специфических антител, проникновение которых через плаценту в организм ребенка вызывает разрушение эритроцитов. Развитие резус-конфликта на раннем сроке беременности может стать причиной выкидыша, а в дальнейшем – преждевременных родов. С каждой следующей беременностью резус-положительным плодом повышенная чувствительность матери к D-антигену и вероятность развития резус-конфликта повышаются, причем это не зависит от того, чем завершилась предыдущая беременность – родами или прерыванием.

На сегодняшний день существует комплекс исследований, предназначенный для выявления резус-конфликта. В него входят:

• определение в крови матери количества специфических иммуноглобулинов к D-резус-антигену ребенка;
• получение инвазивными методами (т.е. посредством проникновения в утробу матери) образцов тканей хориона (оболочки плода, формирующейся на ранних стадиях развития ребенка) и плаценты;
• допплерография фето-плацентарного кровотока (определение скорости движения крови в аорте и средней мозговой артерии плода).

Инвазивные методы исследования в 2-3% случаев могут стать причиной самопроизвольного прерывания беременности, а отсутствие антител не является 100%-ным показателем резус-отрицательности плода. Дополнительная сложность ситуации состоит в возможности развития резус-конфликта на любом сроке беременности.

Кроме перечисленных, существует еще один метод диагностики – выявление ДНК плода в крови матери методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Преимуществами данного метода являются:

• отсутствие угрозы протекания беременности и развития осложнений, т.к. обследование неинвазивное;
• возможность ранней диагностики (начиная с 9-й недели беременности);
• точность (не ниже 96%) полученных результатов (она зависит от состояния плаценты, особенности протекания беременности и увеличивается пропорционально сроку беременности).

Кроме того исследование наличия ДНК ребенка в крови матери позволяет определить, насколько необходимо введение ей иммуноглобулина при отсутствии на сроке 20 недель анти-резусных антител.

Метод ПЦР имеет ограничение, т.к. у 1% женщин с отрицательным резусом может обнаруживаться ген RHD, причиной чему являются его различные мутации. Для таких пациенток исследование резус-фактора плода только методом ПЦР неприемлемо – необходимо также проведение серологических тестов. Резус-фактор считается отрицательным в том случае, если совпадают отрицательные результаты тестов.

ПЦР исследование не проводится, если у пациентки в прошлом были случаи трансплантации тканей и органов.

Аналитические показатели теста:

• выявляемые фрагменты ДНК: 7-й и 10-й экзоны (участки ДНК) гена RHD;
• специфичность теста: 90-100%;
• чувствительность исследования: 150 копий суммарной ДНК матери и ребенка, соответствующего 400 копиям RHD плода в 1 мл исследуемой плазмы крови.

Подготовка к исследованию

Забор крови рекомендуется проводить утром натощак или не ранее, чем через 4 часа после последнего приема пищи.

• накануне обследования желательно избегать физических и психоэмоциональных нагрузок;
• за сутки до отбора крови не употреблять спиртные напитки, за час – не курить;
• перед обследованием согласовать с лечащим врачом возможность отмены препаратов, которые могут повлиять на результат тестирования;
• кровь не отбирается после УЗИ, физиопроцедур и прочих манипуляций;
• непосредственно перед забором материала желательно 10-15 минут провести в спокойствии.

Забор крови не рекомендуется осуществлять после инструментального, ректального, мануального, рентгеновского, ультразвукового обследований, биопсии, кольпоскопии, гастроскопии, физиопроцедур, массажа, прочих диагностических и/или терапевтических манипуляций.

Показания к исследованию

• для наблюдения за течением беременности у женщины с отрицательным резус-фактором с целью своевременного определения риска возникновения резус-конфликта;
• для определения вероятности развития резус-конфликта у женщин с отрицательным резусом при последующих беременностях в случае, если текущая была прервана путем хирургического вмешательства.

Тестирование проводится также в том случае, если есть необходимость введения беременной женщине с отрицательным резус-фактором иммуноглобулина к D-антигену плода с целью профилактики резус-конфликта.

Интерпретация исследования

Результат данного исследования может иметь следующие варианты:

1. Ген резус-фактора (RHD) плода не обнаружен. В этом случае принято считать, что резус-факто плода отрицательный, резус конфликт маловероятен (вероятность его не более 0,1%).

2. Ген резус-фактора (RHD) плода обнаружен. Интерпретация результата в этом случае формулируется так: резус-фактор положительный, резус конфликт возможен.

3. Ген резус-фактора (RHD) плода обнаружить невозможно. Данный результат интерпретируется так: ген (RHD) у матери обнаружен; данным методом невозможно выявить ген (RHD) плода. Не исключается вероятность развития резус-конфликта.

Применяемая для исследования тест-система включает опцию контроля взятия материала (КВМ). Если суммарное ДНК матери и ребенка ниже 0,1 нг в отобранной пробе, результат является недостоверным, а выдаваемый ответ содержит рекомендацию о повторном взятии пробы крови.

Результат теста выдается на бланке лаборатории медицинской компании «Наука». Пример по данному анализу представлен ниже:

Ф.И.О.: Петрова Инна Ивановна Пол: ж Год рождения: хх.хх.хххх

Дата исследования: хх.хх.хххх

Исследование

Результат

Нормы интерпретации

Примечание

[79] Определение Rh плода по крови матери

ВЫПИСКА

Резус-фактор плода (Ген RHD)

Чв 807 Иванова Пелагея Степановна

Внимание. Данное исследование проводится только у серологически резус-отрицательной пациентки при сроке беременности более 8 недель.

Заключение:

Возможно развитие резус-конфликта.

Точность результата зависит от количества ДНК плода, обнаруживаемой в материнской плазме. Данная величина обусловлена состоянием плаценты и возрастает с увеличением срока беременности.

Определение резус-фактора методом ПЦР в режиме реального времени заключается в обнаружении гена RHD плода, кодирующего D-антиген, в крови матери.

Традиционный серологический метод основан на выявлении непосредственно D-антигена на эритроцитах крови.

Согласно литературным данным, в 99% исследований результаты, полученные серологическим методом и методом ПЦР, совпадают. Однако у 1% генотипически резус-положительных лиц серологическим методом может определяться отрицательный резус-фактор, что связано с мутациями в гене RHD и, как следствие, отсутствием или функциональной неполноценностью D-антигена. Поэтому после родов рекомендуется уточнить резус-фактор ребенка серологическим методом.

Литература:

1. Costa J.M., Giovangrandi Y., Ernault P., Lohmann L., Nataf V., El Halali N., Gautier E. Fetal RHD genotyping in maternal serum during the first trimester of pregnancy. British journal of haematology. 2002;119:255-260.

2. Finning K.M., Martin P.G., Soothill P.W., Avent N.D. Prediction of fetal D status from maternal plasma: introduction of a new noninvasive fetal RHD genotyping service. Transfusion. 2002;42:1079-1085.

3. Freeman K., Osipenko L., Clay D., Hyde J., Szczepura A. A Review of Evidence on Non-invasive Prenatal Diagnosis (NIPD): Tests for Fetal RHD Genotype. Workpackage 6, SAFE Network of Excellence Warwick Medical School, UK. 2006.

4. Wagner F.F., Frohmajer A., Flegel W.A. RHD positive haplotypes in D negative Europeans. BioMed Central genetics. 2001;15:10.

5. Минеева П.В. Группы крови человека. Основы иммуногематологии. – СПб. 2004:188.

6. Инструкция по применению набора реагентов для выявления гена RHD плода в крови матери методом ПЦР в режиме реального времени Резус-фактор плода ООО «ДНК-технология». Регистрационное удостоверение № ФСР 2017/5310.

Выявление гена RHD плода в крови матери. Резус‑фактор плода

Генетический маркер, используемый для определения резус-фактора плода по фетальной ДНК. Анализ выполняется только с 10-й недели беременности при отрицательном резус-факторе беременной женщины.

Выявление наличия/отсутствия 7-го и 10-го экзонов гена RHD; генотипирование гена RHD по фетальной ДНК.

Fetal RHD genotyping test.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь беременной женщины с серологическим отрицательным резус-фактором с 10-й недели беременности.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Специальной подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

С точки зрения иммунологии беременность на всём протяжении рассматривается как процесс смены этапных иммунных конфликтов. В основном эти конфликты являются нормальными физиологическими процессами и не только не оказывают патологического воздействия на организм матери и плода, но и помогают нормальному течению беременности. С их помощью реализуются такие этапы беременности, как имплантация плода, формирование гормонального фона беременности и, конечно, сами роды. Кроме того, существует ряд патологических конфликтов, которые могут существенно осложнять течение нормальной беременности, иногда приводя к летальному исходу. Одним из них является резус-конфликт между матерью и плодом.

Система резус (Rh) – одна из самых полиморфных и иммуногенных систем, известных у людей; она представлена группой белковых молекул, расположенных на поверхностной мембране эритроцитов. Наиболее изученными белками (антигенами) этой группы являются антигены D, C, c, E и e, которые кодируются генами RHD и RHCE, расположенными на хромосоме 1. Наличие в геноме гена RHD приводит к появлению на эритроцитах антигена D, что соответствует резус-положительному фенотипу (Rh+). Резус-отрицательный фенотип (Rh-) формируется в результате отсутствия обоих гомологичных аллелей гена RHD.

Важнейший фактор возникновения резус-конфликта при беременности – формирование резус-положительного плода у резус-отрицательной матери. Несмотря на то что кровоток плода и матери разделены плацентой, фрагменты клеток и ДНК плода (фетальная ДНК) могут проходить через неё. Проницаемость плаценты может увеличиваться при ряде патологических процессов: гестоз, заболевания матки, прием лекарственных препаратов, соматическая патология и т.д. При попадании в кровь матери антигенов D плода на них вырабатываются резус-антитела (RhAb). Для матери они безвредны, но, проходя обратно через плаценту, они инициируют развитие гемолитической болезни плода и новорождённого путем связывания с эритроцитами плода и последующим их разрушением. Такие состояния являются фактором риска перинатальной смертности, что подчеркивает необходимость ранних диагностических и превентивных терапевтических стратегий сохранения жизнеспособности плода.

В настоящее время существует два основных метода определения резус-фактора. Первый метод – серологический – подразумевает выявление антигена D на поверхности эритроцитов с помощью специфических антител. Он подходит для широкого рутинного обследования. К существенным ограничениям этого метода относятся: 1) необходимость наличия для исследования живых эритроцитов, что делает невозможным использование его в пренатальной диагностике резус-фактора плода; 2) наличие мутации внутри гена RHD либо изменение уровня его экспрессии. В данных случаях серологическое исследование может дать ложноотрицательный результат (Rh- при наличии гена RHD), так как диагностические антитела не смогут связаться с поврежденными или отсутствующими молекулами антигена D.

Альтернативой серологическому исследованию резус-фактора служит генотипирование на наличие или отсутствие гена RHD. В случае пренатальной диагностики в качестве материала для исследования используется фетальная ДНК, выделенная из крови матери. Генотипирование проводится по нескольким фрагментам (7-й и 10-й экзоны) гена. Необходимое условие, увеличивающим специфичность данного метода, – его использование на сроках 10 и более недель беременности у серологически резус-отрицательных женщин. Основным методом генотипирования в данном случае является полимеразная цепная реакция, выявляющя наличие или отсутствие гена RHD в материале.

С учетом того что концентрация фетальной ДНК в крови матери крайне низкая, а также с учетом возможности наличия серологического ложноотрицательного резус-фактора у матери и наличия мутаций в гене RHD генотипирование резус-фактора плода проводят, исследуя ряд показателей: 1) наличие/отсутствие не менее двух фрагментов (7-й и 10-й экзоны) гена RHD; 2) с учетом сигнала от геномной ДНК матери.

Для чего используется исследование?

• Для прогнозирования развития резус-конфликта между резус-положительным плодом и резус-отрицательной матерью.
• Для решения вопроса о стратегии профилактики гемолитической болезни плода и новорождённого.

Когда назначается исследование?

C 10-й недели беременности.

Что означают результаты?

В процессе исследования формируется четыре типа заключения.

1. Отсутствие обоих фрагментов гена RHD в исследуемом материале на фоне достаточного количества сигнала геномной ДНК. В этом случае констатируется отрицательный резус-фактор плода у резус-отрицательной матери. Данное состояние не требует терапевтической коррекции.

2. Наличие обоих фрагментов гена RHD в исследуемом материале на фоне высокого количества сигнала геномной ДНК. В этом случае констатируется положительный резус-фактор плода у резус-отрицательной матери. Данное состояние может вызывать резус-конфликт (особенно при повторных беременностях) и требует терапевтической коррекции. Следует отметить, что у матери должен быть серологически подтвержденный отрицательный резус.

3. Наличие обоих фрагментов гена RHD в исследуемом материале на фоне равного количества сигнала геномной ДНК. В этом случае констатируется, возможно, положительный генетически резус-фактор у матери, резус-фактор плода идентифицировать не представляется возможным.

4. Наличие слабого сигнала обоих фрагментов гена RHD в исследуемом материале на фоне слабого сигнала геномной ДНК. В этом случае констатируется сомнительный результат. Наличие слабого сигнала геномной ДНК, независимо от сигнала с обоих фрагментов гена RHD, либо наличие одного из двух фрагментов гена RHD в исследуемом материале на фоне высокого количества сигнала геномной ДНК указывает на недостоверный результат. Во всех этих случаях требуется проведение повторного исследования.

Что может влиять на результат?

• На получение достоверного результата может повлиять наличие у матери серологического ложно-отрицательного результата (Rh- при наличии гена RHD) вследствие наличия мутаций внутри гена RHD либо изменение уровня его экспрессии.
• Срок исследования менее 8-10 недель беременности.
• Малое количество фетальной ДНК, например при патологии плаценты.



Данное исследование должно проводиться при каждой беременности у резус-отрицательной матери.

Кто назначает исследование?

Акушер-гинеколог, терапевт, гематолог, врач ОВП.

Генетическое исследование резус-фактора плода

Описание

Резус-фактор (Rh) — это антиген (белок), который находится на поверхности эритроцитов, причём наиболее иммуногенным является антиген D (RhD), присутствие которого и определяет положительный резус-фактор (Rh+). Исследование выполняется с 9 полных недель беременности, т. е. с 10 недели.

Для проведения исследования необходимо предоставить копию УЗИ.
Если резус-отрицательная (Rh-) женщина беременна резус-положительным (Rh+) плодом, её иммунная система начинает вырабатывать анти-D-антитела, вызывающие разрушение эритроцитов плода. Как правило, анти-D-антитела отсутствуют при первой беременности Rh+ плодом, протекающей без осложнений, однако сенсибилизация матери возникает в процессе родов. При каждой последующей беременности или при повреждении плаценты увеличивается риск развития гемолитической болезни плода. 98% случаев гемолитической болезни новорождённых связаны именно с D-резус-антигеном. При раннем проявлении резус-конфликт может стать причиной нарушения развития плода, преждевременных родов или выкидышей.

Ген RHD
Делеция гена RHD в обеих гомологичных хромосомах обуславливает отрицательный резус-фактор. Наличие гена в гомозиготном или гетерозиготном состоянии определяет положительный резус-фактор у обследуемого. В случае если резус-положительные отцы являются гетерозиготными по резус-фактору, то у резус-отрицательных матерей даже при наличии отягощённого анамнеза плод в 50% случаев будет резус-отрицательным. Таким образом, для женщин с резус-конфликтной беременностью появилась возможность проведения пренатальной диагностики с целью определения резус-фактора на ДНК плода, выделенной из ворсин хориона (10–15 недель беременности) или из амниотической жидкости при проведении амниоцентеза (24 неделя беременности).

Если результаты молекулярно-генетического анализа показывают, что плод является резус-отрицательным, то отпадает необходимость в проведении последующих инвазивных процедур, и такие пациентки исключаются из дальнейшего обследования по тяжести развития гемолитической болезни плода. Кроме того, определение гетерозиготного генотипа по резус-фактору (RHD+/RHD-) у отца даёт основание для проведения преимплантационной диагностики при наличии отягощённого акушерского анамнеза (гибель детей от гемолитической болезни) и резус-сенсибилизации у матери. В результате при ЭКО будущей матери будут перенесены только резус-отрицательные эмбрионы.

Так как антирезусную профилактику иммуноглобулином человека рекомендовано проводить на 28 неделе первой и последующих беременностей, то определение резус-фактора плода на ранних сроках является необходимым. Определение Rh- плода в 1–2 триместре беременности позволит сократить расходы на регулярное определение титра анти-D-антител и антирезусную профилактику.

Показания
Беременным (Rh-)-женщинам с 12 по 27 неделю беременности, если (Rh+)-отец является гетерозиготным носителем гена RhD (Генотипирование системы RhD).

Подготовка
Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи.

Интерпретация результатов
При отрицательном результате теста, статус плода считается с высокой вероятностью резус-отрицательным, однако рекомендуется повторять тест на более поздних сроках беременности (но не позднее 27-ой недели) для подтверждения.

Положительный результат теста считается показанием к введению антирезусного иммуноглобулина, однако вопрос о его введении должен решаться только акушером-гинекологом на основании и других методов диагностики резус-конфликта.

При отсутствии антител к Rh-фактору по результатам ИФА и положительном молекулярно-генетическом тесте, рекомендуется введение антирезусного иммуноглобулина в период от 28 недель беременности (для профилактики ГБН) и не позднее 72 часов после родов (для профилактики Rh-конфликта при следующей беременности).

Определение резус-фактора плода по крови матери – методы диагностики и вычисления

Для неинвазивного определения резус-фактора плода используется периферическая венозная кровь беременной женщины, из которой выделяется циркулирующая в ней плодная ДНК, которая анализируется на наличие последовательности ДНК экзонов 7 и 10 гена RHD, кодирующего выработку антигена D. Исследование проводится методом ПЦР в режиме реального времени.

Как известно, концентрация ДНК плода в кровотоке беременной становится достаточной для проведения анализа, начиная с 10 недель беременности (по УЗИ). Важно отметить, что данный способ исследования ДНК плода является неинвазивным, не несет угрозы течению беременности, т.е. абсолютно безопасен как для женщины, так и для плода. Точность используемой методики составляет 96-100% и зависит от количества плодной ДНК в кровотоке беременной.

С биологической точки зрения именно RHD определяет резус-принадлежность крови человека. Обычно для резус-отрицательных людей характерно полное отсутствие гена RHD. В таких случаях результаты генотипирования совпадают с результатами обычного серологического способа определения резус-фактора крови. Однако примерно у 1% людей с серологически резус-отрицательной кровью ген RHD может присутствовать, что, как правило, связано с наличием мутации в RHD, и приводит к отсутствию или неполной экспрессии (работы) гена. В таких случаях результаты генотипирования показывают резус-положительный вариант крови, а серологически выявляется отрицательный либо слабоположительный резус-фактор. Для таких пациенток определить резус-фактор плода невозможно. Однако наблюдение за течением беременности нужно проводить по схеме ведения резус-отрицательных женщин с учетом возможности развития резус-конфликта. В любом случае после родов рекомендуется уточнить резус-фактор ребёнка серологическим методом.

В случае выявления последовательности ДНК гена RHD в крови беременной женщины с резус-отрицательной группой крови делается вывод о положительном резус-факторе плода. В таких ситуациях вероятность развития резус-конфликта и гемолитической болезни реально существует, поэтому женщине и врачам необходимо принимать все меры предосторожности в отношении развития данного грозного осложнения беременности. В целом, положительный результат теста говорит о необходимости строгого динамического контроля за уровнем соответствующих антител в крови беременной и своевременного введения антирезусного иммуноглобулина для предотвращения развития гемолитической болезни плода/новорожденного. Однако вопрос о введении препарата должен решаться только акушером-гинекологом на основании, в том числе, и других методов обследования беременной. При отсутствии антител к Rh-фактору по результатам серологического метода (ИФА) и генетически положительном резус-факторе плода, женщине рекомендуется введедние антирезусного иммуноглобулина на сроке от 28 недель беременности (для профилактики гемолитической болени новорожденного) и не позднее 72 часов после родоразрешения (для профилактики резус-конфликта при следующей беременности).

В случае отсутствия ДНК гена RHD в крови беременной делается вывод о высокой вероятности резус-отрицательной крови плода (однако для подтверждения результата рекомендуется повторить тест на более поздних сроках, но не позднее 27 недель беременности). В такой ситуации вероятность развития резус-конфликта между материнским организмом и плодом практически отсутствует, что говорит об отсутствии необходимости постоянного определения титра анти-D-антител и введения антирезусного иммуноглобулина беременной. А также в случае необходимости проведения инвазивной диагностики плода не увеличивает риски развития гемолитической болезни.

Стоит отметить, что данный анализ актуален только для тех супружеских пар, в которых реально существует угроза развития резус-конфликта при беременности, т.е. женщина обладает резус-отрицательной кровью, а мужчина – резус-положительной. При этом мужчина должен быть гетерозиготен по наличию делеции гена RHD. Только в этом случае у супружеской пары возникает 50%-ная вероятность закладки эмбриона с резус-отрицательной группой крови. Генотип мужчины можно определить, предварительно проведя ему генетический анализ определения генотипа по гену RhD (тест №2008.4).

• Ведение беременности у женщины с резус-отрицательной кровью для своевременного расчета риска развития резус-конфликта.
• При отсутствии в крови резус-отрицательной беременной антирезусных антител на сроке 20 недель следует провести данное исследование для принятия решения о необходимости профилактического введения женщине антирезусного иммуноглобулина.
• Необходимость хирургического прерывания беременности у резус-отрицательной женщины с целью прогнозирования развития резус-конфликта при следующей беременности.

*ВНИМАНИЕ! Анализ имеет смысл проводить тем женщинам, мужья которых обладают резус-положительной кровью и при этом являются гетерозиготными носителями делеции в гене RHD.

Забор крови осуществляется в процедурном кабинете центра Genetico; биоматериал в пробирке с CPDA доставляется в лабораторию, где из венозной крови беременной выделяется фракция ДНК плода, которая анализируется на наличие в ней участков, характерных для гена RHD .

Для выполнения данного исследования беременной женщине нужно сдать кровь (8-10мл) из периферической вены в пробирку с консервантом CPDA.

При использовании этого типа пробирок допускается транспортировка при комнатной температуре (от +18°С до +25°С ) в течение 2 суток.

Допустим прием пищи накануне сбора биоматериала. Рекомендуется начать анализ в течение первых двух часов с момента сдачи крови.

При оформлении данной услуги желательно предоставить результаты генотипирования мужчины (будущего отца ребёнка) по гену RHD .

Кроме того, следует иметь с собой результаты предыдущего УЗИ плода (это нужно для уточнения срока беременности на момент исследования).

Забор крови осуществляется в процедурном кабинете центра Genetico; биоматериал в пробирке с CPDA доставляется в лабораторию, где из венозной крови беременной выделяется фракция ДНК плода, которая анализируется на наличие в ней участков, характерных для гена RHD .

Для выполнения данного исследования беременной женщине нужно сдать кровь (8-10мл) из периферической вены в пробирку с консервантом CPDA.

При использовании этого типа пробирок допускается транспортировка при комнатной температуре (от +18°С до +25°С ) в течение 2 суток.

Допустим прием пищи накануне сбора биоматериала. Рекомендуется начать анализ в течение первых двух часов с момента сдачи крови.

При оформлении данной услуги желательно предоставить результаты генотипирования мужчины (будущего отца ребёнка) по гену RHD .

Кроме того, следует иметь с собой результаты предыдущего УЗИ плода (это нужно для уточнения срока беременности на момент исследования).

В результате предоставляется информация об определенном молекулярно-генетически резус-факторе плода. Делается заключение о вероятности развития резус-конфликта.

В некоторых случаях в результате исследования делается вывод о невозможности установления генетического резус-фактора плода. Такое происходит при генетически резус-положительной крови женщины на фоне полученных для нее ранее серологически резус-отрицательных результатов (см. описание теста).

Кроме того, в минимальном проценте случаев может быть получен сомнительный результат. Тогда пациентку просят повторно предоставить кровь для исследования.

Неинвазивная диагностика резус Текст научной статьи по специальности « Клиническая медицина»

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Н.И. Федорова, Н.К. Тетруашвили, Л.З. Файзуллин, В.Н. Карнаухов, Д.В. Амбрумянц

Целью проведенного исследования явилось неинвазивное определение резус-фактора плода у резус-отрицательных беременных женщин в сроках от 13 до 20 недель. Произведено исследование плазмы периферической крови 74 женщин, определение RhD гена плода осуществляли с помощью метода ПЦР в реальном времени. Согласно полученным результатам в 43 случаях кровь плода была определена как резус-положительная и во всех наблюдениях этот результат подтвердился после обследования крови новорожденного в иммунологическом тесте (специфичность 100%). В 31 наблюдении кровь плодов была определена как резус-отрицательная и после родов у 30 новорожденных этот результат подтвердился при обследовании крови иммунологическим методом (чувствительность — 96,8%). Таким образом, предложенная технология позволяет неинвазивным способом устанавливать резус-принадлежность плода, что дает возможность снизить затраты на ведение беременности, избежать многократного определения резус-антител, не проводить профилактику резус-иммунизации. У резус-сенсибилизированных женщин применение этой технологии позволяет на ранних сроках оценить риск развития резус-конфликта, своевременно начать проведение лечебно-профилактических мероприятий, а в случае резус-отрицательной принадлежности крови плода избежать инвазивных процедур.

Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Н.И. Федорова, Н.К. Тетруашвили, Л.З. Файзуллин, В.Н. Карнаухов, Д.В. Амбрумянц

NON на тему «Неинвазивная диагностика резус

НЕИНВАЗИВНАЯ ДИАГНОСТИКА РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ПЛОДА ПО КРОВИ МАТЕРИ НА РАННИХ СРОКАХ БЕРЕМЕННОСТИ

Н.И. Федорова, Н.К. Тетруашвили, Л.З. Файзуллин, В.Н. Карнаухов, Д.В. Амбрумянц, В.М. Сидельникова,

ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» ул. академика Опарина, 4, Москва, Россия, 117997

Целью проведенного исследования явилось неинвазивное определение резус-фактора плода у резус-отрицательных беременных женщин в сроках от 13 до 20 недель. Произведено исследование плазмы периферической крови 74 женщин, определение RhD гена плода осуществляли с помощью метода ПЦР в реальном времени. Согласно полученным результатам в 43 случаях кровь плода была определена как резус-положительная и во всех наблюдениях этот результат подтвердился после обследования крови новорожденного в иммунологическом тесте (специфичность 100%). В 31 наблюдении кровь плодов была определена как резус-отрицательная и после родов у 30 новорожденных этот результат подтвердился при обследовании крови иммунологическим методом (чувствительность — 96,8%). Таким образом, предложенная технология позволяет неинвазивным способом устанавливать резус-принадлежность плода, что дает возможность снизить затраты на ведение беременности, избежать многократного определения резус-антител, не проводить профилактику резус-иммунизации. У резус-сенсибилизированных женщин применение этой технологии позволяет на ранних сроках оценить риск развития резус-конфликта, своевременно начать проведение лечебно-профилактических мероприятий, а в случае резус-отрицательной принадлежности крови плода избежать инвазивных процедур.

Иммунологическая несовместимость плода и матери по резус-фактору является основной причиной гемолитической болезни новорожденного [1, 2, 7]. До 95% всех клинически значимых случаев гемолитической болезни плода обусловлены несовместимостью по Rh-фактору. Сенсибилизация резус-отрицательной матери резус-положительными эритроцитами плода в 1% случаев может происходить в процессе беременности и в 10% случаев — после родов при поступлении плодовой крови в материнский кровоток [2, 7]. У Rh-отрицательной женщины при беременности от резус-положительного мужчины в 55—60% случаев плод является резус-положительным. В связи с тем, что из резус-положительных мужчин 60% являются гетерозиготными, а 40% — гомозиготны по резус-фактору, согласно акушерским рекомендациям беременность резус-отрицательной женщины от резус-положительного мужчины следует вести как беременность резус-положительным плодом [3, 7]. Для предотвращения резус-сенсибилизации матери используют анти-резус-иммуноглобулины. В настоящее время в мире принята тактика введения анти-резус-иммуноглобулинов всем резус-отрицательным женщинам при резус-положительной крови супруга с 28 по 34 неделю беременности [1,

2, 7], что позволяет снизить риск иммунизации на 80%. В то же время при наличии резус-отрицательного плода эта профилактическая мера, связанная с введением белкового препарата (анти-КЪоф) иммуноглобулина), является бесполезным, небезопасным и дорогостоящим мероприятием.

В этой связи пренатальное определение резус-фактора плода неинвазивным методом позволит избежать ненужного медикаментозного лечения при наличии резус-отрицательного плода и назначать профилактическое введение анти-КЬоф) иммуноглобулина только при положительной резус-принадлежности плода [8].

Другим клиническим аспектом является необходимость определения резус-фактора плода у женщин с наличием резус-иммунизации в течение предыдущих беременностей и высоким титром антител, которые являются анамнестическими. В такой ситуации титр резус-антител не может быть критерием тяжести гемолитической болезни плода, более того, он может нарастать даже при отрицательной резус-принадлежности плода в течение данной беременности. Определение резус D гена в таком случае является исключительно важным, так как помогает избежать инвазивных процедур (амниоцентеза, кордоцентеза) для оценки степени тяжести гемолитической болезни плода при высоких титрах антител и отрицательном резус-факторе плода.

В настоящее время в мировой науке предпринимаются попытки определения в крови матери ДНК эмбрионального и фетального происхождения [5, 6]. Так как в геноме резус-отрицательных людей полностью отсутствует участок ДНК с геном для RhD-антигена, выявление в крови резус-отрицательной беременной этой ДНК однозначно указывает на резус-положительную кровь плода.

Цель проведенного исследования: определить возможность неинвазивного определения резус-фактора плода у резус-отрицательных беременных женщин в сроках от 13 до 20 недель.

Материалы и методы. Материалом для исследования служила плазма периферической крови 74 беременных с резус-отрицательной кровью в сроках геста-ции от 13 до 20 недель.

В исследование вошли первобеременные женщины с отсутствием резус-иммунизации (51,4%), повторнобеременные женщины без резус-иммунизации (35,1%) и сенсибилизированные женщины с рождением ребенка с гемолитической болезнью различной степени выраженности (13,5%). Определение RhD гена проводили с помощью метода ПЦР в реальном времени. В качестве праймеров использовали: левый — (F-1): 5′-CCTCTCACTGTTGCCTGCATT-3′; правый — (F-2): 5′-AGT GCC TGC GCG AAC ATT-3′. В качестве зонда использовали зонд 5′-(Fam)-tacgtgagaaacgctcatgacagc-(BHQ1)-3′. Для оценки специфичности определения резус-принадлежности крови методом ПЦР были исследованы 75 образцов донорской крови, резус-принадлежность которых была установлена предварительно иммунологическим методом с использованием гелевых планшет DG Gel ABO/Rh (2D) (GRIFOLS, Испания).

Результаты исследования и их обсуждение. Был определен порог чувствительности выявления ДНК гена RhD, для чего использовались различные раз-

Федорова Н.И. и др. Неинвазивная диагностика резус-принадлежности плода по крови матери.

ведения очищенной ДНК резус-положительного человека с известной ее концентрацией. Результаты, представленные на рис. 1, показывают, что минимальное количество ДНК, которое давало положительный результат на ген RhD, составило 9 пикограмм ДНК, или 2,4 генома в реакционной пробирке, что соответствует 108 пикограмм ДНК, или 33,8 генома на 1 мл крови (рис. 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рис. 1. Амплификация гена RhD на ДНК человека:

1 и 2 — соответственно, контрольные резус-положительная и резус-отрицательная ДНК;

3—12 — резус-положительная ДНК, внесенная в реакционную пробирку в количестве,

соответственно, 610 , 210 , 6,710 , 2,210 , 7,410 , 2,410 , 81, 27, 9 и 3 пикограммы; 13 — маркер молекулярного веса ДНК

Для оценки специфичности определения резус-принадлежности крови методом ПЦР были исследованы 75 образцов донорской крови, резус-принадлежность которых была установлена предварительно иммунологическим методом. Все 43 резус-положительных образцов крови показали положительный результат и при исследовании методом ПЦР. Из 32 образцов резус-отрицательной крови методом ПЦР в 31-м образце также был получен резус-отрицательный результат, а в 1-м — резус-положительный, что соответствует специфичности по отрицательным пробам 98,9%.

Определение эффективности установления резус-принадлежности крови плода по периферической крови матери методом ПЦР проводилось путем обследования 74 беременных с резус-отрицательной кровью. Из них у 43 кровь плода была определена как резус-положительная, и во всех случаях этот результат подтвердился после обследования крови новорожденного в иммунологическом тесте с использованием гелевых планшет DG Gel ABO/Rh (специфичность 100%).

В 31-м случае методом ПЦР кровь плодов была определена как резус-отрицательная и после родов у 30 новорожденных этот результат подтвердился при обследовании крови иммунологическим методом (чувствительность — 96,8%). В одном случае у новорожденного при иммунологическом исследовании кровь

оказалась резус-отрицательная. При повторном исследовании крови этого новорожденного методом ПЦР вновь был получен положительный результат на наличие ДНК гена RhD. По-видимому, в данном случае мы имеем дело с так называемым «слабым» резус-геном, который встречается среди резус-отрицательных женщин в европейской и российской популяциях с частотой 4—5% [4]. Выводы.

Таким образом, предложенная технология позволяет неинвазивным способом с высокой чувствительностью и специфичностью устанавливать резус-принадлежность плода, используя для исследования плазму периферической крови резус-отрицательной женщины в сроках гестации более 13 недель. Кроме того, определение у пациенток резус-отрицательной принадлежности крови плодов позволяет снизить затраты на ведение беременности, избежать многократного определения резус-антител, не проводить профилактику резус-иммунизации. У резус-сенсиби-лизированных женщин применение этой технологии позволяет на ранних геста-ционных сроках оценить риск развития резус-конфликта, своевременно начать проведение лечебно-профилактических мероприятий, а в случае резус-отрицательной принадлежности крови плода избежать инвазивных процедур и оптимизировать ведение беременности.

[1] Радзинский В.Е. Руководство к практическим занятиям по акушерству: учеб. пособие / В.Е. Радзинский [и др.]. — М.: Мед. информ. агентство, 2004. — 576 с.

[2] Сидельникова В.М. Гемолитическая болезнь плода и новорожденного / В.М. Сидельни-кова, А.Г. Антонов. — М.: Триада-Х, 2004. — 576 с.

[3] American College of Obstetricians and Gynecologists. Management of alloimmunization during pregnancy. ACOG practice bulletin no. 75, American College of Obstetricians and Gynecologists, Washington, DC. — 2006.

[4] Bianchi D.W. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal Rhesus D: ready for Prime(r) Time / D.W. Bianchi, N.D. Avent, J.M. Costa, C.E. van der Schoot // Obstet. Gynecol. — 2005. — Vol. 106. — № 4. — P. 682—683.

[5] Chitty L.S. SAFE — the Special Non-invasive Advances in Fetal and Neonatal Evaluation Network: aims and achievements / L.S. Chitty, C.E. van der Schoot, S. Hahn // Prenat. Diagn. — 2008. — Vol. 28. — № 2. — P. 83—88.

[6] Hahn S, Recent progress in non-invasive prenatal diagnosis / S. Hahn, X.Y. Zhong, W. Holzgreve // Semin. Fetal. Neonatal. Med. — 2008. — Vol. 13. — № 2. — P. 57—62.

[7] Protocols for High-Risk Pregnancies — Edited by J.T. Queenan, J.C. Hobbins, C.Y. Spong — 4-th Edition — 2005 — 736 p.

[8] Wright C.F. The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal diagnosis / C.F. Wright, H. Burton // Hum. Reprod. Update. — 2009. — Vol. 15. — № 1. — P. 139—151.

Федорова Н.И. и др. Неинвазивная диагностика резус-принадлежности плода по крови матери.

NON-INVASIVE PRENATAL DIAGNOSIS: DETECTION RHESUS FACTOR STATUS IN MATERNAL BLOOD OF RHESUS NEGATIVE WOMEN IN EARLY PREGNANCY

N.I. Fedorova, N.K. Tetruashvili, L.Z. Faizullin, V.N. Carnaukchov, D.V. Ambrumianz, V.M. Sidelnikova,

Scientific Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of Federal Agency for High Technologic Medical Aid Oparina str., ap. 4, Moscow, Russia, 117997

The objective of the study was non-invasive prenatal detection fetal rhesus factor status in blood of rhesus negative women during 13—20 weeks of pregnancy. Cell-free fetal DNA were detected in the maternal blood of 74 pregnant women using molecular techniques (real time PCR method). In 43 cases fetal rhesus factor was positive, and these results were confirmed after delivery in all cases (specificity 100%). In 31 cases rhesus factor status was detected as negative, in 30 cases results were confirmed (sensitivity — 96,8%). If future large scale trials are successful it could result in significant savings in the use of anti-D and a reduction in hospital visits for many RhD-negative women. For the clinical management of the pregnancies of alloimmunized women, the development non-invasive detection fetal rhesus factor status makes it possible to evaluate risk of hemolytic disease of the newborn and to avoid invasive procedures in cases of rhesus negative fetuses.

ХРОМОСОМНЫЕ НАРУШЕНИЯ ПЛОДА ПО КРОВИ МАТЕРИ

Что такое неинвазивный пренатальный ДНК-тест и почему его делают при беременности?

Современный уровень развития медицины позволяет женщине узнать, здоров ли ее ребенок, когда тот еще находится в утробе. Этот вопрос является главным для всех будущих родителей, а порой он стоит настолько остро, что в пренатальной диагностике появляется неотложная необходимость.

ЧТО ЭТО ТАКОЕ?

Неинвазивный пренатальный ДНК-тест (сокращенно НИПТ) – относительно новая методика обследования беременных.

Неинвазивный метод позволяет сделать анализ на генетические отклонения у плода по крови (из вены) матери. С 9 недели беременности в кровь женщины в небольшом количестве проникают кровяные клетки плода. Именно их выделяют из общей массы, обнаруживают ДНК и проводят подробный генетический анализ.

Этот метод дает точный ответ на вопрос, здоров ли ребенок. НИПТ относится к одним из самых точных исследований в акушерстве.

ГРУППЫ РИСКА

Необходимость провести исследование генетического здоровья будущего ребенка может возникнуть даже у здоровых мамы и папы, если оба родителям или один из них входит в так называемую группу риска по генетическим патологиям. Безусловно, вопрос здоровья ребенка заботит любую беременную, и любая может сделать НИПТ по собственному желанию, для этого не нужно иметь направление от генетика или особые основания. Но есть категории будущих мам, которым такое тестирование наиболее желательно провести.

Если базовый обязательный скрининг показал у женщины высокие риски рождения малыша с синдромом Дауна, синдромом Патау или другими хромосомными патологиями, неинвазивные методы станут достойной альтернативой травматичным инвазивным способам установить истину. В случае получения результата отрицательного, женщина может не беспокоиться и не соглашаться ни на какие инвазивные методы.

Неинвазивный тест желательно сделать женщинам, у которых прежняя беременность завершилась рождением ребенка с хромосомными отклонениями, выкидышем на раннем сроке, замиранием на любом сроке. С возрастом женщин стареют и яйцеклетки, ухудшается их репродуктивное качество, а потому риски рождения детей с генетическими аномалиями тем выше, чем выше возраст беременной. Всем женщинам старше 35 лет, которые собираются родить ребенка, желательно сделать такой тест.

Женщинам, которые не уверены в отцовстве, а также женщинам, которые состоят в близкородственном браке, тест не просто желателен, а необходим. Не будет лишним пройти обследование и в том случае, если в роду были случаи рождения детей с генетическими проблемами как со стороны мужчины, так и со стороны женщины.

Стоит провести подобную диагностику и тогда, когда у мамы или папы в анамнезе есть пусть даже пролеченная алкогольная или наркозависимость – длительные вредные привычки приводят к мутациям определенных генов, ухудшению качества яйцеклеток и сперматозоидов, что нередко приводит к развитию нарушений хромосомного набора ребенка.

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ

Тестирование не проводят женщинам, срок беременности которых менее 9 акушерских недель. В женской крови до этого срока кровяные клетки плода не определяются, материала для исследования ДНК добыть не получится.

Если женщина беременна двойней, тест делать можно, но вот при многоплодной беременности тройней в проведении диагностики откажут, слишком сложно будет идентифицировать ДНК каждого из плодов.

Такая диагностика мало чем поможет семейным парам, которые вынуждены были прибегнуть к помощи суррогатной матери. По крови женщины, которая не является истинной биологической матерью, не удастся безошибочно идентифицировать ДНК малыша. Если беременность наступила в результате ЭКО с применением донорской яйцеклетки, тестирование также невозможно.

Женщине будет отказано в неинвазивном ДНК-тестировании и в том случае, если недавно она перенесла трансплантацию костного мозга, ей проводилось переливание крови. Всем остальным анализ проведут.

Проведение исследования и подготовка к нему

От беременной не требуется никакой подготовки. Нужно записаться на прием в ООО «Симилия» и прийти к назначенному времени. Для исследования берут самый обыкновенный анализ крови из вены (не более 20 мл).

Может ли тест не получиться? Теоретически, конечно, может, ведь делают его люди, а человеческий фактор очень непредсказуем. Но в этом случае беременную вызовут на повторный забор крови.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Тестирование определяет вероятность наличия у ребенка синдромов Дауна, Тернера, Эдвардса и Патау.

Если женщина вынашивает одного ребенка, список аномалий, на которые будет исследован биоматериал, шире. При двойне заключение будет включать в себя только синдром Дауна, Эдвардса и Патау, а точнее, вероятность того, что такие аномалии есть у одного или двух детей.

Дополнительно неинвазивный пренатальный ДНК-тест с огромной точностью определяет пол ребенка, а также его резус-фактор и группу крови, что может быть очень важно в случае риска гемолитической болезни плода, которая развивается из-за иммунного отторжения организмом резус-отрицательной беременной ребенка с положительным резус-фактором крови.

В среднем, точность результата пренатального неинвазивного теста составляет около 98-99%. Заметьте, это не 100%, но и не те 70%, которые «дает» общий скрининг в женской консультации.

Трактовка результатов не вызовет вопросов у женщины и членов ее семьи. Если ребенок здоров, риски будут оценены в 0,1 – 1%. Отзывы врачей об этом исследовании довольно положительные, вероятность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов ничтожно мала.

Плюсы и минусы

Пренатальный тест дает уникальную возможность выявить вероятные аномалии в развитии крохи рекордно рано. В анализе крови матери определяют ДНК плода со срока в 9-10 недель. На таком сроке не проводится обязательный скрининг. Поэтому тестирование дает возможность получить информацию о состоянии малыша еще до прохождения скрининговых исследований первого триместра. Некоторые женщины, сделавшие тест и убедившиеся, что ребенок здоров, от скрининга в консультации с чистой совестью отказываются вообще.

Новое слово в пренатальной генетической диагностике – возможность определить пол ребенка на таком раннем сроке, на каком это не может сделать никакое современное УЗИ. При этом точность определения пола будет 99%, а на УЗИ больше 80% достоверности не даст никто.

Спокойствие во время беременности, уверенность в том, что с малышом все хорошо, очень нужны будущей матери. Ведь из-за переживаний могут развиться самые различные осложнения беременности. Пренатальные тесты дают такое спокойствие и уверенность.

Определение резус-фактора плода по крови матери – методы диагностики и вычисления

В России процент резус-сенсибилизированных женщин достигает 1,2 % (Сидельникова В.М. и соавт. 2004; Савельева Г.М. и соавт., 2004). В развитых странах мира количество женщин c Rh-сенсибилизацией равно 0,1-0,2 %. Столь низкий процент достигнут благодаря внедрению в клиническую практику специфической профилактики путем введения антирезус-иммуноглобулина несенсибилизированным резус-отрицательным женщинам. Разница в количестве сенсибилизированых женщин возникла по нескольким причинам, одна из которых – высокая стоимость антирезус-иммуноглобулина, покупать который приходится за свой счет. Хотя вводить данный препарат необходимо только тем резус-отрицательным беременным женщинам, чей плод является резус-положительным.

Вопреки мнению, что плацента образует барьер между матерью и ребенком, это не так (Loetal., 1996). Многочисленные исследования показали, что как целые клетки плода, так и внеклеточные фетальные ДНК проходят через плаценту и циркулируют в материнском кровотоке.

Интактные фетальные клетки, циркулирующие в материнском кровотоке, являются привлекательной мишенью для неинвазивной пренатальной диагностики, а именно для диагностики резус-фактора плода, пола плода и хромосомных аномалий путем простого кариотипирования. Хотя существование фетальных клеток в материнской крови известно более века, непосредственно интактные фетальные ядерные красные кровяные клетки с целью пренатальной диагностики не использовались до 1990 года. С этого времени выделение и обнаружение клеток плода из крови матери начали интенсивно исследоваться, и стали появляться различные методы выделения фетальных клеток, которые были в разной степени успешными. Однако результаты исследований были неутешительные. Это было обу­- словлено недостаточностью интактных клеток плода, циркулирующих в материнском кровотоке (около 1 клетки в миллилитре материнской крови) (Bianchi и соавт., 1997), низкой эффективностью исследований (Bianchi и соавт., 1997). Хотя некоторые клетки плода (в частности ядерные красные кровяные клетки плода) имеют сравнительно короткую продолжительность жизни в материнской крови, фетальные клетки других типов могут сохраняться в материнской крови десятилетия после беременности и потенциально способны вызвать ложноположительные результаты при последующих беременностях. Таким образом, несмотря на то, что современные исследования пытаются улучшить технику сортировки клеток, большинство последних научных исследований сосредоточены на бесклеточной ДНК плода в крови матери, которая представлена в достаточном количестве (Lo и соавт.1998).

Огромное количетво человеческой ДНК расположено внутри клетки, но присутствие небольшого количества вкДНК в циркуляции и здоровых, и больных женщин было открыто в 1947 г. Хотя их биологический источник и потенциальная функция остаются неопределенными, предполагают, что это продукт апоптоза, в результате которого происходят фрагментация и выход хромосомных ДНК из клетки. Присутствие ДНК плода в материнской циркуляции была продемонстрировано Lo и соавторами в 1998 году.

Фетальные ДНК образуются путем апоптоза плацентарных клеток (трофобласта), полученных от и составляют примерно 3-6 % от общих бкДНК в материнском кровотоке в начале и конце беременности соответственно (Lo и соавт. 1998) (оставшиеся 94-97 % составляют материнские вкДНК).

ДНК плода можно обнаружить с 4-й недели гестации, хотя надежно только с 8 недели концентрация его возрастает с увеличением гестационного возраста- от 16 фетальных геномов на миллилитре крови матери в первом триместре беременности до 80 в третьем триместре) -с острым пиком в течение последних 8 недель беременности (Lo и др., 1998). В отличие от фетальных клеток, вкфДНК быстро выводится из крови матери с периодом полураспада 16 мин и не определяется через 2 ч после родов.

Цель исследования – оценить метод неинвазивной диагностики резус-фактора плода по крови беременной женщины.

Материалы и методы исследования

Для определения резус-фактора плода была использована фетальная ДНК из плазмы крови беременной резус-отрицательной женщины. В исследовании принимали участие 150 беременных резус-отрицательных женщин. Были использованы образцы венозной крови объемом 7 мл. В каждом случае женщины подписывали информированное согласие.

Для выявления гена резус-фактора применялась ПЦР в реальном времени с использованием диагностических наборов для идентификации гена резус-фактора плода в крови матери «ДНК-резус ребенка» производства ООО «Ген-технология» (Россия, РУ № ФСР2010/09565).

Определение резус-фактора плода по крови беременной резус-отрицательной женщины основывается на том, что в плазме крови беременной женщины присутствует внеклетчная фетальная ДНК.

Для правильного определения резус-фактора плода по крови беременной женщины необходимо соблюдение следующих условий:

1. Срок беременности – с 10 недель.

2. Правильное обращение с плазмой, выделение ДНК в максимально быстрые сроки.

3. Выделение ДНК с использованием надёжной технологии.

4. Организация работы в ПЦР-лаборатории согласно действующим национальным нормам.

5. Чёткое следование инструкции.

Исследование проводится в несколько этапов:

1. Взятие крови и выделение плазмы. Исследуемым материалом для проведения анализа является венозная кровь беременной резус-отрицательной женщины. Кровь сдаётся натощак, собирается в пробирку с антикоагулянтом EDTA в количестве 7-10 мл. В течение 24 ч с момента взятия крови следует отобрать плазму и перенести в новую пробирку. Плазма должна доставляться в лабораторию в течение 16-24 ч после взятия материала.

2. Выделение ДНК. Проводится колоночно-адсорбционным методом с использованием рекомендуемых комплектов наборов, предназначенных для выделения циркулирующих нуклеиновых кислот из биологических жидкостей согласно методике производителя.

3. Проведение амплификации с детекцией в режиме реального времени. Пробоподготовка – стандартная для проведения ПЦР. Подготавливаются реакции для непосредственного выявления гена резус-фактора в исследуемой пробе, а также контрольные реакции, подтверждающие правильность выполнения исследования. Реакция занимает от 1,5 до 2 часов (в зависимости от скорости изменения температуры амплификатором).

4. Регистрация и учёт результатов анализа.

Результаты исследования и их обсуждение

Все 150 женщин, вступившие в исследование, были резус-отрицательные по результатам серологического анализа. Для 115 из них стал известен резус-фактор рожденного ребенка.

Резус-фактор рожденных детей оценивался серологическим методом в роддоме.

ДНК-анализ 76 образцов указал на положительный резус-фактор плода, в 39 случаях был установлен отрицательный резус-фактор. Результаты анализа были подтверждены анализом крови детей после их рождения. В одном случае результат анализа не совпал (при отрицательном резус-факторе по данным тест-системы фактический резус-фактор оказался резус-положительным). Следует отметить, что срок беременности для этой пациентки составил 9 недель, в то время, как минимальным сроком, гарантирующим правильность результатов анализа, является срок 10 недель. Следовательно, данный результат не может использоваться при оценке аналитических характеристик тест-системы. У двух детей резус фактор был определен неправильно в роддоме. После полученния результата анализа на определение резус-фактора этих детей, не совпадающего с нашими результатами, у них был взят буккальный соскоб и проведено генетическое определение резус-фактора. Результат данного анализа подтвердил правильность определеного нами резус-фактора плода по крови беременной женщины.1,8 % (2 ребенка) – неправильное определение резус-фактора детей в роддоме

Таким образом, чувствительность и специфичность применяемого метода диагностики составили 100 %.

Выводы

– новые диагностические наборы для идентификации гена резус-фактора (RHD) «ДНК-резус ребенка» российского производства можно рекомендовать для внедрения в медицинскую практику акушерам-гинекологам для ранней неинвазивной диагностики резус-фактора по крови беременной женщины;- определение резус-фактора на раннем сроке беременности позволяет избежать дорогой медикаментозной профилактики;

– введение антирезус-иммуноглобулина всем резус-отрицательным женщинам, беременным резус-положительным плодом, в дальнейшем приведет к снижению процента резус-сенсибилизированных женщин в России.

Рецензенты:

Шатунова Е.П., д.м.н., доцент, заведующая отделением гинекологии Клиник Сам ГМУ, г. Самара;

Шляпников М.Е., д.м.н., доцент, зам. главного врача по акушерству и гинекологии ММБУ ГКБ№ 2 им. Н.А. Семашко, г. Самара.